DNA/基因合成与纯化

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DNA/基因合成与纯化

现如今固相亚磷酰胺三酯法是普遍采用的DNA合成方法，具有高效，快速偶联的优点。其基本原理是：将核苷酸单体按照3′→5′磷酸二酯键链接，使其具有天然DNA分子的全部生物学活性和排列顺序。同时，合成过程中将暂时不需要的基团保护起来以防止活跃基团发生连接反应生成副产物，且在下一轮缩合反应之前去除保护基以保证不断形成专一的3′→5′核苷酸排列。

首先将欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3′OH通过1个长的烷基臂与固相载体保护。然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸酸链：

1. 去保护：以苯磺酸(或三氯醋酸)处理带有保护基的核苷，去除5′末端的DMTr，暴露出5′OH，经洗涤后进行下步反应。

2. 耦联反应：加入经四唑激活的核苷N2，使之与核苷N1上的5′OH起耦联反应，乙腈洗涤。

3. 加帽反应：加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链(2%以下)乙酰化，乙酰化的链不参加下一步反应，如此有利于纯化所需全长的DNA片段。

4. 氧化反应：加入碘，使三价的亚磷酸转变为更稳定的五价磷酸。

上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去。当整个链达到预定的长度后，从固相载体上切下，氨解法脱去保护基，并经过分离纯化得到所需要析最后产物。

DNA的纯化常采用丙烯酰胺凝胶电泳纯法，具体操作如下：

1. 从合成柱上洗脱的寡核苷酸片段，冰冻、干燥、去氨水，溶于适量水中后，占样于15～20%丙烯酰胺凝胶制备胶上，按10V/cm条件电泳，过夜。

2. 电泳完毕后，取下凝胶于EB染色后观察，或直接将含寡核苷酸片段的凝胶置于硅胶荧光板上(CMC板)紫外线灯下，根据分子量的标准切下所需的区段(呈黑色)，将胶块置少量缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/L NaCl)，捣碎胶块，25～42℃浸泡过夜(4～24小时)，或将胶块置于有少量缓冲液的透析袋中，通电下，寡核苷酸片段即进入透折袋中。

3. 洗脱的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗涤，真空抽干后即可应用。

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