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RNA干扰整体实验服务—SiRNA实验

第二部分：细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养
使用10％胎牛 DMEM培养液，37℃下置于5％CO2培养箱中。待细胞融合至80％，用0．25％胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板，待细胞融合至约70％后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照

YYYY细胞图片如下：

1）细胞培养方法：略
二、细胞转染
材料：YYYY细胞；XXXX基因siRNA（20Μm, 合成）；Lipofectamine 2000试剂（使用前贮存在+4℃）；Opti-MEM I 低血清培养基（使用前37℃预热）；6孔组织培养板
转染步骤：使用Lipofectamine 2000转染siRNA。转染前一天，4-5×104细胞接种在6孔板上，2mL含FBS的基础培养基；选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70%；按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine 2000复合物：a.以250ul Opti-MEM I稀释5ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。b.以250ulOpti-MEM I稀释250pmol siRNA，轻轻混匀。c.孵育5分钟后，混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染；将siRNA - Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合；6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率；37℃，CO2培养箱孵育48小时，进行WB，real-time检测。
转染效率检测：

荧光镜下视野光镜下视野

通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知，细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。

三、siRNA最佳浓度筛选
实验分组：A 正常组；B 阴性对照组；C XXXX-1转染组；D XXXX-2转染组；E XXXX-3转染组
第一个筛选实验：荧光定量PCR实验
实验分组：

NO	样本编号
1	A
2	B
3	C
4	D
5	E

实验试剂：Trizol, Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR仪,ABI 7900型；引物由primer3.0软件设计,并由艾柏森生物合成。步骤(略)。
结果数据：Ct（基本循环数）；ΔCt（基本循环与内参循环数差值）；ΔΔCt*（最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ）：目的基因mRNA相对含量（* 相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth，et al. (2001) METHODS 25, 402–408）。
扩增曲线：在实时荧光PCR扩增反应中，荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段：基线期，指数期初期，指数期，平台期，在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线，阴性对照(模板为水)无显著荧光信号，提示荧光定量PCR反应程序正常运行，目的基因得到有效扩增，实验操作规范，试剂符合实验要求。
熔点曲线：从软件中显示形状只有一个峰值，没有出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一，有利于结果分析。

Sample	CT	ΔCт	ΔΔCт	RQ	RQ mean	SD
1	26.1312	5.7691	-2.2238	4.6712	4.4587	0.6585
1	26.3320	6.0975	-1.8954	3.7203
1	26.0145	5.6754	-2.3175	4.9847
2	27.0101	5.9786	-2.0143	4.0398	3.9841	0.0485
2	27.0077	6.0073	-1.9856	3.9603
2	27.0584	6.0103	-1.9826	3.9520
3	28.1032	8.3378	0.3449	0.7874	0.5186	0.2327
3	28.7212	9.3670	1.3741	0.3858
3	28.5034	9.3785	1.3856	0.3827
4	28.0210	7.8063	-0.1866	1.1381	1.3224	0.2119
4	28.0042	7.6421	-0.3508	1.2753
4	27.9142	7.3570	-0.6359	1.5539
5	26.3742	7.0578	-0.9351	1.9120	2.1770	0.3723
5	26.5004	6.6129	-1.3800	2.6027
5	26.6316	6.9812	-1.0117	2.0163
1-内参	20.3621
1-内参	20.2345
1-内参	20.3391
2-内参	21.0315
2-内参	21.0004
2-内参	21.0481
3-内参	19.7654
3-内参	19.3542
3-内参	19.1249
4-内参	20.2147
4-内参	20.3621
4-内参	20.5572
5-内参	19.3164
5-内参	19.8875
5-内参	19.6504

第二个筛选实验：WB实验
实验试剂：略
WB实验操作流程：略
实验结果：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

Lanes:	Lane 1	Lane 2	Lane 3	Lane 4	Lane 5
Rows	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)	(IOD)
XXXX	216.21	200.86	60.691	124.52	166.52
GAPDH	299.62	295.32	293.13	307.85	312.45
样本	A	B	C	D	E

以上实验得出XXXX-1干预效果最好，可选择做后续实验。

第三部分：细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验
实验分组：A 正常细胞培养组；B XXXX-1干预组

一、MTT方法检测细胞毒性
原理：MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞（Formazan），死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤：在96孔板加入细胞100μL/孔（约1×104），置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时；加入适当浓度的受试化合物；将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间；将5×MTT用 DilutionBuffer稀释成1× MTT；每孔加50μL 1× MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲月赞；吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀；酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析：细胞存活率% =（加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD）×100％。注：本底OD值（完全培养基加MTT，无细胞）

0h 570nm波长各孔OD值：

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.457	0.452	0.463	0.457
B	0.461	0.448	0.454	0.454
本底	0.007	0.009	0.010	0.009

12h 570nm波长各孔OD值：

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.503	0.518	0.511	0.511
B	0.494	0.501	0.489	0.495
本底	0.009	0.012	0.011	0.011

24h 570nm波长各孔OD值：

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.618	0.607	0.624	0.616
B	0.573	0.566	0.584	0.574
本底	0.007	0.008	0.008	0.008

48h 570nm波长各孔OD值：

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.744	0.765	0.738	0.749
B	0.636	0.663	0.657	0.652
本底	0.009	0.008	0.008	0.008

72h 570nm波长各孔OD值：

实验分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.821	0.817	0.834	0.824
B	0.701	0.724	0.695	0.707
本底	0.013	0.008	0.009	0.010

二、细胞粘附能力实验
试剂耗材及仪器设备：结晶紫染色液；1×PBS, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南第二版》；仪器：美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml，以每孔100μl分别包被96孔板；37℃包被2h，用1×PBS洗涤2次，再用1% BSA封闭2h。；将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液，每个样本计数3次取平均数，调节细胞浓度为3×105个/ml，以每孔200μl加入包被好的培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中孵育2h；取出96孔板，轻轻洗去未粘附的细胞，每孔用100μl 4%中性甲醛固定，30分钟后洗去；每孔加100μl 0.5%结晶紫，室温染色2h,，蒸馏水洗涤一次，阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液，放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。
检测结果：

0h 570nm波长各孔OD值：

Ln OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.586	0.563	0.592	0.580
B	0.575	0.580	0.577	0.577

Fn OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.649	0.633	0.654	0.645
B	0.627	0.641	0.638	0.635

12h 570nm波长各孔OD值：

Ln OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.594	0.584	0.571	0.583
B	0.546	0.543	0.558	0.549

Fn OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.656	0.639	0.643	0.646
B	0.609	0.611	0.603	0.608

24h 570nm波长各孔OD值：

Ln OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.602	0.591	0.603	0.599
B	0.511	0.508	0.502	0.507

Fn OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.671	0.665	0.653	0.663
B	0.563	0.574	0.585	0.574

48h 570nm波长各孔OD值：

Ln OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.575	0.582	0.586	0.581
B	0.474	0.463	0.481	0.473

Fn OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.648	0.659	0.661	0.656
B	0.521	0.516	0.534	0.524

72h 570nm波长各孔OD值：

Ln OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.569	0.573	0.568	0.570
B	0.392	0.407	0.384	0.394

Fn OD值

分组	样品	平行样品	平行样品	平均值
A	0.636	0.641	0.652	0.643
B	0.489	0.476	0.486	0.484

三、细胞侵袭实验
实验材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液，培养细胞。
结果统计：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；

细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A

平均107个细胞

平均66个细胞

平均98个细胞

平均54个细胞

平均103个细胞

平均61个细胞

四、细胞迁移实验
材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔径8um.
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基；取细胞悬2ml加入Transwell小室；培养细胞：常规培养24h。
结果统计：用棉签擦去上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A