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降解组测序 | |
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降解组测序，又称大规模平行末端分析，其结合了高通量测序技术与生物信息学分析的优势，对细胞或组织中由miRNA介导的降解mRNA的剪切片段进行深度测序分析，准确高效地筛选出miRNA靶基因，为研究miRNA以及其对应的靶基因的相互关系提供了有效手段。
于传统miRNA靶基因筛选方法相比，降解组测序具有高通量、高准确性、高分辨率、重复性好等优势（见表）。主要原理是：在植物体内绝大多数的miRNA是利用剪切作用调控靶基因的表达，且剪切常发生在miRNA与mRNA互补区域的第十位核苷酸上。测序过程中，可以直观地发现在mRNA序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的miRNA剪切位点。
基本流程为： 1. mRNA被miRNA剪切后，产生2 个片段, 5' 剪切片段和3' 剪切片段。其中, 5' 剪切片段包含5' 帽子结构和3' 羟基; 3' 剪切片段则包含自由的5' 单磷酸和3'polyA 尾巴。 2. 以5'adapter捕获miRNA 的切割产物：5'adapter 可与5' 单磷酸RNA 连接而与含有帽子结构的5' 剪切片段或其它缺少5' 单磷酸基团的RNA 无法连接， 3. oligo(dt)3'-adapter 将连接有5'-adapter 的3' 切割产物反转录成cDNA。 4. 扩增cDNA 后，利用限制性内切酶Mme I 对PCR 产物进行酶切，酶切产生长度为20–21 nt 的片段。 5. 将酶切后的产物与3' 双链DNA adapter 连接并进行PCR 扩增，最终产物进行凝胶纯化后，建立一个包含经miRNA 切割产生的靶基因3' 端剪切片段的文库。 6. 对文库进行高通量测序以检测切割位点。
服务流程： 1. 提取总RNA 2. 构建文库 3. PCR 4. 上机测序 5. 生物信息学分析 |
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