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基因甲基化研究 | |
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DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）。DNA的甲基化可引起基因的失活，可引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
根据研究水平，甲基化的检测分为三种：基因组甲基化水平(MethylationContent)的分析，候选基因甲基化的分析以及基因组层次的DNA甲基化模式(Methylationpattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)的分析。
基因组甲基化水平的分析主要采用HPLC或高效毛细管电泳法（HPCE）；候选基因甲基化分析采用甲基化敏感性限制性内切酶PCR/Southern法、重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性的PCR等方法；基因组范围的DNA甲基化模式(Methylationpattern)与甲基化谱(MethylationProfiling)分析方法主要有：限制性标记基因组扫描、甲基化间区位点扩增等。
甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化。
亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）：该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。流程见上图： 1. 基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段 2. DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。 3. 采用 EZ DNA Methylattion-Gold kit 进行 Bisulfite 处理 4. 脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。 5. 合格的文库用于上机测序。
高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）：在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化 |
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