基因步移（genomic walking）实验

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基因步移实验

用以鉴定已经克隆的特定DNA片段侧翼顺序的方法。用已经被鉴定的特定DNA片段一端或两端的末端片段为探针去筛选基因组DNA文库，对已被鉴定的DNA一端或两端并与之重叠的克隆进行筛选与鉴定。然后用新鉴定克隆中与原始克隆DNA非共有的一端的片段作探针，进行新的筛选与鉴定。依次类推，可以弄清跨度为几百个kb的连接片段。基因组步移分为基因组结合文库的染色体步移技术和基于PCR扩增的技术。

TAIL-PCR法可用于基因步移研究。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。该技术省去了诸如：酶切、连接、加尾等传统的基因克隆步骤，而且克服了常规PCR不能对已知DNA序列侧翼的位置序列进行扩增的缺点，能快速地分离到目标序列。其具有：操作简便、成本低、高特异性、高灵敏性、快速等优点。

TAIL-PCR一般分为三轮PCR反应。第一轮PCR反应（如图1）由五次高退火温度（一般65℃）的特异性反应、一次极低退火温度（一般25℃）的低特异性反应，与由二个高退火温度（一般65℃）的高特异性反应与一个低退火温度（一般44℃）的低特异性反应所组成的15个热不对称的超级循环构成。通过五次高特异性的反应，使spl与已知的序列(载体或T-DNA等)退火并延伸，提高目标序列的浓度。一次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上，随后进行15次热不对称的超级循环。经过上述反应得到了不同浓度的三种类型的产物：由特异性引物和简并引物扩增出的特异性产物和由同一简并引物或特异引物扩增得到的非特异性产物。第二轮PCR反应（如图2）则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过15次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性地扩增，而非特异性的产物被压制到极低的含量。第三轮PCR反应（如图3）又将第二轮PCR反应的产物稀释1000倍作为模板，一般设置为普通的PCR

反应或热不对称的超级循环。通过上述三轮PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。